干细胞泉源的肝细胞：远景辽阔的研究HBV熏染的新工具
乙型肝炎病毒（HBV）熏染常导致肝硬化和肝细胞癌，是引起举行性肝脏疾病的主要病因。遗传特征研究发明，HBV的复制周期特异性地依赖于宿主物种类型及其肝细胞。只管用克隆的病毒基因组转染肝肿瘤泉源的细胞系后可实现HBV复制和病毒颗粒组装，然而只有在人原代肝细胞(PHH)或树鼩原代肝细胞内才华获得完整的全病毒复制周期，包括通过受体介导的病毒穿入、将核壳体转送至细胞核、rcDNA修复和cccDNA的形成。直到2002年Gripon等先获得HBV易感细胞系，他们从一名HCV熏染患者的肝脏中作育出肝祖细胞系(HepaRG)，再经特定的作育条件分解后获得HBV的易感性。该作育条件包括一个为期周围的分解历程，终获得胆管样细胞和肝样细胞(HLC)。后者和PHH相似，表达肝细胞特异的标记物，如细胞色素P450和人白卵白等。HepaRG细胞分解后对HBV具有易感性，说明分解的细胞表达了HBV受体，但其时并不清晰HBV受体是什么。十年之后，北京的李文辉小组发明钠-�；堑ㄋ嵫喂沧硕嚯�(NTCP)正是恒久以来一直在探索的HBV受体，HepaRG细胞分解后也确实诱导了NTCP的表达。
另一条探索获得HBV易感细胞系的途径是对差别泉源的干细胞举行分解，从而获得HLC，如人类胚胎干细胞(hESC)、肝祖细胞和骨髓间充质干细胞等。使用hESC获得HLC的计划通常包括三个要害办法：(1)诱导内胚层的天生，(2)肝细胞定向分解，(3)肝细胞成熟。2006年，Yamanaka及其同事通过将Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4这四个转录因子导入小鼠成纤维细胞而获得了多醒目细胞，这些重编程的诱导性多醒目细胞(iPSC)可以分解为HLC。随后泛起了许多的优化计划，这些计划均遵照一些相似的原则。简而言之，先通过激活素A和Wnt3a来诱导天生内胚层，这一历程可通过免疫荧光法(IF)检测转录因子SOX17、FOXA2和GATA4举行评估；其次，通过成纤维细胞生长因子或化学制剂二甲基亚砜(DMSO）来诱导肝母细胞的形成，后者也可用于诱导HepaRG细胞的易感性，这一历程通过肝细胞核因子4(HNF4α)、细胞角卵白19(CK19)、甲胎卵白(AFP)和上皮细胞粘附分子(EPCAM)的表达举行监测；后，在含有肝细胞生长因子和抑瘤素M的作育条件下将肝母细胞向成熟肝细胞分解，该历程往往伴有脱唾液酸糖卵白受体(ASGR)、白卵白、细胞角卵白18(CK18)和CYP3A4的表达。成熟HLC还具备尿素天生、吲哚菁绿(ICG)摄取和糖原存储等肝细胞功效。别的，将HLC移植入动物模子后可增进肝功效的恢复。现在没有将HBV的易感性作为评价HLC功效的标准。
在之前举行的一项研究中，Shlomai等次证实HBV可以熏染iPSC泉源的HLC。该研究批注，在肝细胞成熟历程中，保存显着诱导的NTCP表达，从而获得对HBV的易感性，提醒人iPSC泉源的HLC可以应用于HBV生物学研究。主要的是，该研究为从某些患者群体以及具有某种遗传多态性的个体中获得具有HBV易感性的细胞提供了研究偏向。
美国国立卫生研究院的Jake Liang 等使用人ESC泉源和人iPSC泉源的HLC建设了有用可控的HBV体外模子，证实和拓展了上述发明。该小组使用他们之前建设的分解计划，在重编程的历程中对已知的肝细胞标记物，如维甲酸X受体(RXR)、HNF4α和NTCP受体的表达举行动态剖析,发明所有相关标记物都保存诱导性表达。并且，与PHH和HepaRG细胞相比，干细胞泉源的HLC中诱导性NTCP表达水平更高。别的，在对PHH举行单层细胞作育时其NTCP迅速消逝，而干细胞泉源的HLC中NTCP的保存时间更长。这一发明尤其主要，由于这是恒久作育时病毒可以举行撒播的先决条件。研究职员还确认在HBV熏染后，视察到cccDNA天生、病毒RNA表达、HBsAg和HBeAg渗透以及病毒增殖等。凭证细胞内HBsAg染色效果，当使用300基因组当量（mge）HBV时，约30%的干细胞泉源的HLC可被病毒熏染。与之前视察到的PHH和HepaRG细胞以及表达NTCP的HepG2-NTCP相比，这种熏染率颇为“低效”。然而，当病毒负荷增添至1000 mge时，细胞熏染率险些增添至100%。这一体现与PHH相似，且所有HLC亚群均有易感性。然而，HepaRG细胞在分解后有50%为不具有易感性的胆管细胞，且只有一个肝细胞亚群可被熏染。因此，.0需要较高的病毒负荷来获得高乙型肝炎病毒熏染率未必是某一特定体外熏染系统的缺陷，可能在一个扩散速率有限的二维细胞作育系统中，将病毒从未成熟的形式转化为可以团结NTCP的形式是一个较慢的历程（见表1）。
+号数代表抗原水平：++++，很是高；+++，高；++，中等；+，低；±，很是低。
评价栏：（+）和（-）划分代表正面和负面评价，（±）代表中立
Ni Y等一个主要发明是在终分解完成后HLC的易感性可一连达4周，这和PHH形成鲜明的比照。这一发明勉励了作者继续研究若是作育时间足够长，允许HBV在熏染后举行多个周期的增殖，HLC是否可支持子代病毒的撒播。HBV病毒包膜源性抑制剂myrcludex B可滋扰NTCP介导的HBV熏染，作者通过恒久使用该抑制剂证实当病毒侵入肝细胞的通路被壅闭后，该作育系统中病毒标记物水平会显著降低。别的，他们还接纳免疫化学要领证实抑制剂可阻止相近熏染细胞群的形成。现在尚未在其它细胞作育系统中发明类似效果，该发明与移植PHH的uPA/SCID小鼠体内试验数据一致。值得注重的是，在作育系统内这种低水平的病毒撒播仍缺乏以抵达对导入病毒举行净扩增的要求。这与鸭HBV熏染模子的效果显着差别，在鸭原代肝细胞中可视察到病毒净扩增。这可能反应了两种病毒的侵入通路有显着差别。因此，在未来的研究中很有须要将HLC置于三维作育情形中来视察病毒撒播的水平是否增添。
为评估HLC是否适用于研究病毒-宿主相互作用以及药物筛选，作者用siRNA先后默然两个已知的宿主因素NTCP和APOBEC3B，发明默然要害宿主依赖因子NTCP使细胞易感性降低了2倍，而默然宿主抑制因子APOBEC3B使HBV复制增添了约1.5倍。后，作者对HLC是否适适用于高通量药物筛选举行了研究，终筛出两个潜在的抗病毒药物，染料木黄酮和RXR拮抗剂PA452。
以上对hiPSC或hESC泉源的HLC举行应用探索，为未来针对HBV复制周期的研究提供了很是主要的新型工具。为了将体外作育系统改善为更类似于肝脏自然状态（类器官、三维作育、生物反应器），很主要的一个方面是通过研究HLC的应用来取代PHH，后者泉源有限。后，关于直接修改干细胞系基因的研究希望将对特异性宿主因素的研究爆发深远影响，如从具有已知某种多态性或遗传疾病的成人成纤维细胞中制备iPSC，将其转化为个体特异的HLC，并用于乙肝病毒研究。
